> 门诊 > 国内试管婴儿 > 促进染色质开放,提高基因编辑效率

促进染色质开放,提高基因编辑效率

来源:产品密探网 时间:2021-01-10 编辑:疯狂造娃网 手机版

促进染色质开放,提高基因编辑效率

  CRISPR-Cas9基因编辑技术是21世纪最重要的技术革命之一,2012年开始大放异彩,2020年获得诺贝尔化学奖。作为一个基因编辑的利器,它是进行基因治疗的理想工具。CRISPR-Cas9基因编辑的基本工作原理是:Cas9核酸内切酶与导向RNA(sgRNA)形成复合物,sgRNA与DNA进行碱基配对后,Cas9核酸内切酶对DNA进行切割造成DNA双链断裂。在无同源重组模板的情况下,细胞通过非同源末端链接的方式进行自我修复,如果同时导入人为设计的包括特定基因或DNA判断的同源重组模板,就可以诱使细胞通过同源重组的方法修复DNA双链断裂,在这一过程中,人们可以得到理想的精确基因编辑结果。

  人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)由外周血细胞等成体细胞重编程而来,具有无限的自我更新和多向分化能力,在基础研究和再生医学中具有广阔的应用前景。为了进一步发挥人iPSC的应用潜能,通常需要对iPSC进行基因编辑,比如通过引入基因突变创建疾病模型,通过矫正致病基因进行替代治疗,或者通过精确插入嵌合人工受体(CAR)进行免疫治疗。人类原代CAR-T细胞和CAR-NK细胞为治愈肿瘤带来了新的希望,但其体外扩增能力有限。如果能够在iPSC内进行基因编辑,包括敲除免疫检查点基因,敲入CAR和疗效增强因子,然后再分化为CAR-T细胞和CAR-NK细胞,将有望建立通用型免疫细胞,用于各种类型的肿瘤免疫治疗。但是,这些都依赖于对iPSC细胞的高效基因编辑。

  程涛/张孝兵教授团队长期致力于利用CRISPR-Cas9技术提高人iPSC的 基因编辑效率。团队使用双切质粒供体(Zhang et al., Genome Biology, 2017)和瞬时BCL-XL过表达(Li et al., Nucleic Acids Research,2018)的方法,大大提高了人多能干细胞的基因编辑效率。使用新型双切供体模板表达凝血因子F8,在小鼠模型中已经成功治愈了血友病A(Zhang et al., Genome Biology, 2019)。然而,前期大部分基因编辑研究都是靶向开放状态的染色质或高表达基因位点,这些位点通常比未表达的基因或染色质处于关闭状态的区域具有更高的编辑效率。不同于原核生物中松散的DNA,真核细胞基因组DNA紧密包装并包裹在组蛋白周围,然后进一步压实形成更高级的染色质结构。这种复杂结构可能会阻碍Cas9-sgRNA与DNA靶序列结合,以及降低同源修复模板的可及性。

  染色质的开放度由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase, HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDAC)共同调控。乙酰化导致开放活跃的染色质状态。HDAC使组蛋白去乙酰化,与带负电荷的DNA紧密结合,染色质致密卷曲。组蛋白去乙酰化酶抑制剂(histone deacetylase inhibitors,HDACi)则可通过提高染色质特定区域组蛋白乙酰化。团队通过筛选HDACi,来进一步提高CRISPR-Cas9在人类细胞中的基因敲入效率。研究人员比较了6种不同的HDAC抑制剂:丁酸钠(NaB)、Trichostatin A (TSA)、Vorinostat (SAHA)、valproic acid (VPA)、Entinostat (MS275)和Panobinostat (LBH589)等对诱导多能干细胞开放位点和非开放位点基因编辑效率的影响。

  研究发现,TSA、Entinostat 和Panobinostat显著提高了同源模板介导的基因编辑效率,在非开放位点的效果尤其明显,精准编辑效率提高3倍。利用这一优化后的方法,在基因开放区域的精确插入效率可达50%以上,在非开放区域可达40%以上。这一新方法极大地降低了单克隆筛选基因编辑的iPSC的工作量,提高了工作效率,尤其是需要双等位基因编辑的情形。这些研究结果将助力于通用性CAR-T细胞治疗以及iPSC-CAR-NK新型免疫治疗。

  该研究近日在Science China Life Sciences在线发表。论文的第一作者为张健萍副研究员、博士生杨智学和技术员张凤,通讯作者为Charles Wang、程涛和张孝兵。

  研究详情请阅原文:

【双子宝宝※国际生殖医疗顾问:电话微信同步18848216628(同微信号),供卵、供精、包男孩、包双胞胎、包成功、包上户口、代孕产子一条龙服务,24小时在线欢迎咨询】


北京不孕不育专家预约挂号 北京不孕不育预约 北京不孕不育专家 北京不孕不育医生
知识标签:北京不孕不育专家 北京不孕不育医生

最近更新

'); })();